一、薄层色谱法
（一）适用范围
本方法适用于小麦中NIV和DON的测定。
（二）原理
小麦中的NIV和DON经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层板展开后，加热薄层板，由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使NIV和DON在波长365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。
（三）试剂
以下试剂均为分析纯。
1. 甲醇；
2. 三氯甲烷；
3. 丙酮；
4. 异丙醇；
5. 三氯化铝（AlCl3·6H2O）：化学纯。
6. Amberlite XAD-4树脂：用水和1 mol/L氢氧化钠洗树脂，水洗至中性后，弃去水，加甲醇浸泡放置过夜，偶尔轻轻振摇。弃去甲醇，再依次用甲醇洗、水洗，储存于水中；
7. 硅胶G：薄层色谱用；
8. 标准溶液：分别配制DON和NIV标准溶液。精密称取2mgNIV和DON，用甲醇溶解，转入10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成含NIV和DON各200μg/mL的标准储备液。再用甲醇稀释成含NIV和DON各20μg/mL的标准使用溶液。
（四）仪器
1. 小型粉碎机；
2. 电动振荡器；
3. 75mL玻璃蒸发皿；
4. 色谱柱：内径1.5cm、长21cm，下端具玻璃砂芯滤板和活塞；
5. 底部具0.2mL刻度尾管的10mL具塞浓缩瓶；
6. 玻璃板：5cm×20cm；
7. 薄层涂布器：0.3mm；
8. 展开槽：内长25cm、宽6cm、高4cm；
9. 紫外光灯：波长365nm；
10. 微量注射器：10，50μL。
（五）操作步骤
1. 样品溶液的制备
（1）提取：称取20g粉碎并过20目筛的样品，置于250mL具塞锥形瓶中，用100、100mL甲醇-水（96+4）提取二次，每次振荡30min，过滤，将滤液滤入一200mL的量筒中，再用少量甲醇-水（96+4）洗涤残渣，过滤，滤液并入量筒中，用甲醇-水（96+4）定容至200mL，摇匀。取25mL滤液，置于100mL分液漏斗中，加入7mL水，摇匀，加50mL石油醚振摇1min，静置，分取甲醇水层于70℃水浴上减压浓缩至约6mL，加30mL水稀释后进行柱净化。
（2）柱净化：于色谱柱中加入XAD-4树脂，高度为4cm。赶走柱内气泡，调节流速为1~1.5mL/min，使水面降至浸过树脂顶层。加入拌品溶液，待样品溶液完全流进柱后，用30mL蒸馏水淋洗，速度为2.5mL/min，挤出柱内剩留的水，关闭活塞，加入10mL甲醇，用玻璃棒搅动赶走柱内气泡，调节流速为2.5mL/min，再用10mL×5甲醇洗提毒素于一锥形瓶中，挤出隹内剩留甲醇溶液。于70℃水浴上减压浓缩至干，用少量甲醇将锥形瓶中的残渣洗入蒸发皿中或直接洗入浓缩瓶中，挥去溶剂后，用0.2mL甲醇溶解残渣，供薄层层析用。
2. 薄层色谱测定
（1）薄层板的制备：称取4.6g硅胶G，加11mL15％三氯化铝（AlCl3·6H2O）水溶液，研磨至粘稠状，铺成三块5cm×20cm的薄层板，置室温干燥后，于105℃活化1h，储干燥器中备用。
（2）展开剂
① 测定IVN用展开剂
横展剂：三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（4+2.5+3.5+0.6）；
纵展剂：三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（3+2.5+4.5+1.2）；
② 测定DON用展开剂：
横展剂：乙醚、乙醚-丙酮（95+5）或无水乙醚。任选其中一种，使样品DON点偏离原点约0.7cm，刚好与杂质荧光分开。
纵展剂：三氯甲烷-丙酮-异丙醇（8+1+1）；三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（7.5+1+1.5+0.1）。
（3）点样：在每块薄层板上距下端2.5cm的流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。>基线上点样。
① 测定IVN用薄层板点样方式：取两块薄层板，在每块薄层板的基线上距左边缘1.2cm处滴加8μL样液，在第二块板的样液点上加商4μL标准溶液。再分别在薄层板上距上端6cm处的横线上、并与下端基线上样液原点相对应的位置上滴加约2μL的标准液，作为NIV经横向展开后的定位点。先横展薄层板，然后再于薄层板的基线上距左边缘0.8cm处滴加4μL标准样液，纵展薄层板。此为样品含1cm/kgNIV的点样量。根据测定情况，用增减样品和标准溶液滴加量的方式，或稀释样品溶液进行含量测定。
② 测定DON用薄层板点样方式：取两块薄层板，在每块薄层板的基线上距左边缘0.8cm处点8μL样液，在第二块板的样液点上加滴2μL标准溶液。再分别在两块板的基线上距左边缘1.2cm处滴加4μL标准液。在薄层板上距上端1.5cm处的横线上并与下端基线上两点相对应的位置上点二个DON标准点，各2μL，作为DON横向展开后的定位点。此为样品含1mg/kgDON的点样量。根据测定情况，用增减样品和标准液滴加量的方式，或稀释样品溶液进行含量测定。
样品溶液的最大点样量是32μL，与标准40ngNIV和DON相比较，则本方法可达到的检出限度为0.125μg/g。
（4）展开
① 横展：在展开槽内倒入10mL横展剂，将点好样的薄层板靠样液点的长边斜浸入溶剂，展至板端过1~2min，取出，通过挥发溶剂2~3min。注意：在测定NIV的薄层板上滴加标准液。
② 纵展：
A. 对测定NIV的薄层板：在展开槽盖内面贴二层水饱和的滤纸，放入薄层板后，用电吹风热风吹展开槽盖，使滤纸上水分蒸发直至展开槽四壁出现水蒸气。纵展薄层板1h，取出，通风挥发溶剂10min。如空气湿度大，NIV荧光点变扁，可用减少展开槽内空气的湿度甚至减少纵展剂中含水量来调节。
B. 对测定DON的薄层板：纵展15cm，取出，通风挥发溶剂10min。
（5）显荧光：将经过双向展开后的薄层板置烘箱中加热7~10min。加热温度DON为130℃、NIV为160~170℃。取出薄层板，置冷的表面上5min后于波长365nm紫外光灯下观察，对测定NIV的薄层板放置15min后观察效果更好。
（6）观察与评定：薄层板经横展后，板上的NIV和DON荧光点均横向移位了，正是根据这一点使样品NIV和DON荧光点摆脱了杂质荧光的干扰。利用与薄层板上端标准点横向移动的位置和纵展后标准荧光点的Rf值比较定性，与标准荧光点比较荧光强度定量。如果在第一块薄层板上滴加32μL样液后，样液点未显出NIV和DON荧光点，而在第二块薄层板上滴加32μL样液加40ng标准所显荧光强度与40ng标准NIV和DON荧光强度相等，则样品中NIV和DON的含量为阴性或在0.125ppm以下。
（7）薄层光密度计测定
参照“第二十三章第一节（五）2.（6）”项下。

（8）计算



式中：X——样品中NIV或DON的量，mg/kg；
A——薄层板上测得样液点上NIV与DOV的量，μg；
V1——加入甲醇溶解残渣的体积，mL；
V2——滴加样液的体积，mL；
D——样液的总稀释倍数；
m——用甲醇溶解残渣相当样品的量。
（六）注意事项
当小麦中加入NIV和DON在含量为1mg/kg和0.125mg/kg时，各测定五次，NIV的平均回收率为82％、82％，DON的回收率为90％、80％。