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| 展青霉素薄层色谱法检测 |
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| 整理时间：2008-7-5 12:53:00 查看次数：432 关键词：展青霉素，薄层色谱法
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| 展青霉素（Patulin）是由荨麻青霉（Penicillium urticae Bainier）、扩展青霉（P.expansum Link）和棒曲霉（Aspergillus clavatus Desmazieres）等霉菌代谢产生的。它主要存在于霉烂的水果及制品中。该毒素是一种神经毒，具有致癌和致畸性。
展青霉素为无色结晶，熔点110℃。
展青霉素溶于水和乙醇。在碱性溶液中不稳定并可丧失其生物活性，在酸性溶液中较稳定，耐热。
本文介绍采用薄层色谱法测定展青霉素，包括样品的提取制备，薄层扫描仪的操作条件以及定量计算。 |
从70年代起，国外对水果制品中展青霉素的污染调查进行了大量的工作。美国、丹麦等国家制定了推荐性卫生标准。展青霉素的测定方法有气相色谱法和薄层色谱法。我国建立了双向薄层扫描定量测定法。一、薄层色谱法本方法为苹果汁中展青霉素的薄层色谱分析方法，为A.O.A.C方法。（一）原理用乙酸乙酯提取苹果汁，然后将抽提液在硅胶柱上净化。浓缩后经薄层色谱分离，用3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙（3-methyl-2-benzothia-zolinone hydrazone, MBTH）盐酸溶液喷显，在波长360nm紫外光下，展青霉素呈黄棕色荧光斑点，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量来测定含量。（二）仪器和试剂
1. 小型粉碎机；
2. 电动振荡器；
3. 薄层色谱分析所需仪器：玻璃板20cm×20cm；涂布器；固定盘；微量注射器（10μL）；展开槽；360nm紫外灯；喷洒瓶；
4. 硅胶：柱层析用：E.Merk硅胶60，0.063~0.2mm；薄层用E.Merk硅胶G；（或相当产品）；
5. 展青霉素标准溶液：称取0.500mg展青霉素标准品，溶于三氯甲烷中，使其浓度为10μg/mL，0℃避光保存，用时避光升至室温；
6. 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸（MBTH·HCL）溶液：把0.5g3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙水合盐酸盐（MBTH·HCL·H2O）溶于100mL水中，4℃保存，每三天制备一次；
7. 无水硫酸钠；
8. 苯、乙酸乙酯均重蒸后使用。（三）样品提取将50mL样品入250mL分液漏斗中，用3份50mL乙酸乙酯剧烈提取三次，将上层提取液合并；并用20g无水硫酸钠干燥约30min；用玻璃棒将开始形成的团块捣碎，将上清液转入250mL有刻度的烧杯中；用2份25mL乙酸乙酯洗涤硫酸钠，并加到提取液中。在蒸气浴上用缓慢的氮气流蒸发至25mL以下（不要蒸干）。冷却至室温。如需要，可用乙酸乙酯调整体积至25mL，并用苯稀释至100mL。（四）纯化方法在装有约10mL苯的色谱管的底部放一团玻璃棉并弄实，加15g用苯调制的硅胶浆。用苯洗涤管壁，待硅胶沉降后，将溶剂放至硅胶顶部。小心地把样品提取物加入管中，放至硅胶顶部，弃去洗脱液。用200mL苯-乙酸乙酯（75+25）以约10mL/min速度洗提形青霉素。在蒸气浴上通入氮气流将洗提液蒸发近干。用三氯甲烷将残留物移入具聚乙烯塞的小瓶中，在氮气流下蒸气浴蒸干，加入500μL三氯甲烷溶解残渣，供薄层色谱用。（五）薄层色谱分析用10μL注射器吸取样品提取液。在0.25mm的薄板上距底边4cm线上滴2个5μL，1个10μL的样液点及1，3，5，7，10μL的标准溶液点。在一个5μL样液点上加滴5μL标准液。用甲苯-乙酸乙酯-90%甲酸（5+1+4）将板展开至溶剂前沿达到距离板端4cm处时取出薄层板，在通风橱中干燥，用0.5%的MBTH喷板，130℃加热15min；在波长360nm紫外灯下观察，展青霉素呈黄棕色荧光斑点，其Rf值约0.5，检出能力应正好为1μL标准液（μg/mL）。（六）结果制定用目测比较样品与标准溶液荧光斑点强度。当样品斑点与内标斑点重叠，且样品斑点的Rf及颜色与展青霉素标准液相同时，可认为样品的荧光斑点即为展青霉素。含内标的样品斑点，其荧光强度应比样品或内标单独存在时更强。如果样品斑点的强度介于两个标准斑点之间，可用内推法确定其浓度，或重新点滴适当体积的样品及标准溶液，以得到较为接近的估计值。如果最弱的样品斑点仍比对应的标准溶液斑点强，则应将样品提取物稀释，并重新点样进行薄层分析。计算公式：
X=（S×Y×V）/50×A式中：X——样品中展青霉素含量，μg/L；
S——与测定样品相当的标准溶液微升数，μL；
Y——标准溶液的浓度，μg/mL；
V——最后稀释的样品提取液的微升数，μL；
A——荧光强度与S（标准物）相当的样品提取液所点滴的微升数，μL。（七）验证方法
1. 制备薄层色谱法：在薄层板上点滴提取液。在板的一边应点滴展青霉素标准及10μL加内标的提取液。在标准与样品域间划线，以防样品区域间的交叉沾污。用上述展开剂将薄层板展开。在空气中干< |
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