|
1 引言
河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）是存在于豚鱼类体内和多种脊椎动物及无脊椎动物体内的一种剧毒生物碱，是毒性最强的非蛋白类神经毒素之一。TTX是通过与钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠通道，从而阻滞动作电位，阻止神经肌肉兴奋的产生，导致与之相关的生理活动障碍。主要是神经肌肉麻痹，甚至引起死亡[1]。每年我国每年都有十几人因误食河豚中毒身亡的事件发生。因此，寻找一种准确可行的TTX血浆浓度检测方法有重要的现实意义。
TTX的定量测定方法有小鼠生物法[2]，免疫学测定法[3]、液质联用法[4,5]、直接紫外检测法[6]以及碱衍生化后荧光检测器检测[7]等，这些方法绝大多数是对水产品（大多为河豚鱼）中河豚毒素的含量进行检测。由于TTX难溶于水，又不溶于任何有机溶剂，只溶于稀酸，使TTX很难与血浆样品中的内源性物质相分离，造成其血浆样品很难分析，目前国内外关于血浆中TTX定量检测的方法还非常少。
本研究建立了一种酸性的双有机沉淀剂提取TTX血浆样品的新方法，并以庚烷磺酸钠作为离子对试剂，应用反相离子对高效液相色谱紫外检测（RPIPHPLCUV）法对血浆中TTX进行分析。本方法能很好地将TTX从血浆样品中提取出来，并能很好地与血浆中的内源性物质相分离，可以实现定量检测，且方法准确，专属性强，重现性好。
2 实验部分
2.1 仪器与试药
LC20AB高效液相色谱仪，包括LC20AB泵、SPD20A检测器、LCsolution工作站和DGU20A3脱气仪（日本岛津公司）；5417R超速低温离心机(德国Eppendorf公司)；DU800型核酸蛋白分析仪（美国Becman公司）。
TTX标准品由南宁枫叶药业有限公司提供 (纯度为99.0％)；乙腈（ACN, Tedia，USA），色谱纯；庚烷磺酸钠（Across，比利时）；三氟乙酸（TFA，Across，比利时）；分析纯乙酸（国药集团化学试剂有限公司）；去离子水（Millipore Q，USA）。
2.2 色谱条件
色谱柱：Agilent Zorbax SB C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）；Agilent C18预柱；检测波长：196 nm；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；流动相：10%ACN90%的8 mmol/L庚烷磺酸钠与0.005%TFA混合溶液，流动相用NaOH调到至pH 5.0。
2.3 对照品溶液的制备
精确称取TTX标准品适量，用0.1%HAc溶解制备成含211 mg/L TTX的标准品贮备液，于－20 ℃冰箱中保存。临用时，精确吸取贮备液适量，用0.1% HAc稀释至所需浓度，即为TTX对照品溶液。
2.4 血浆样品预处理
于100 μL空白SD雄性大鼠血浆中，加入TTX对照品溶液100 μL，水100 μL，涡旋0.5 min，加入700 μL沉淀剂（Ｖ（乙腈）∶Ｖ（含0.5%HAc的甲醇）=3∶1)，涡旋0.5 min，离心10 min（14000 r/min，4 ℃），取上清液20 μL进样测定。
3 结果与讨论
3.1 实验方法的选择
3.1.1沉淀剂的选择 TTX结构如图1，其活性基团为1、2、3位的胍基和4、8、9、10位的羟基，pKa为8.76(水），其晶体难溶于水，易溶于稀酸，不溶于任何有机溶剂。即在常用的有机提取溶剂（乙醚、乙酸乙酯、氯仿等）中不溶。故难以采用液液萃取方式将其自血浆中萃取出来。因其易溶于稀酸，故采用在酸性条件下用有机溶剂直接沉淀蛋白法进行血浆样品预处理。
图1 TTX的分子结构 (C11H17O8N3, 319.2)（略）
Fig.1 Structure of tetrodotoxin（TTX） TTX (C11H17O8N3, 319.2)
实验中首先考察了有机溶剂种类对血浆样品提取的影响。共考察了3种有机沉淀剂：甲醇（含0.5%HAc），乙腈（含0.5%HAc）和Ｖ（乙腈）∶Ｖ（含0.5%HAc的甲醇液）=3∶1混合溶液。沉淀剂的用量均为血浆体积的2倍。每种沉淀剂平行实验3次，考察结果见表1。表1中A表示用不同的沉淀剂沉淀血浆蛋白后，提取得到的TTX用反相离子对色谱分离后得到的相应的基线构成之面积称峰面积。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h>峰面积平均值。A0表示用水代替血浆样品，同法测定，得到水溶液中TTX在反相离子对色谱分离中相应的峰面积平均值。将A与A0相比，计算出采用不同沉淀剂时TTX血浆样品的提取率。从表1中可以看出，以２倍血浆体积的甲醇（含0.5%HAc）为沉淀剂，TTX受杂质干扰严重，无法定量测定。而以２倍血浆体积的乙腈（含0.5%HAc）和Ｖ（乙腈）∶Ｖ（含0.5%HAc的甲醇液） =3∶1混合溶液为沉淀剂，TTX与血浆中的杂质得到了很好的分离，可以定量测定，提取效率以最后一种沉淀剂为最好，可以达到89.6%。因此在后续实验中选择Ｖ（乙腈）∶Ｖ（含0.5%HAc的甲醇液）=3∶1混合溶液为沉淀剂。
表1 不同沉淀剂处理后血浆样品中TTX的提取效率（n=3）（略）
Table 1 Extraction efficiency of TTX from plasma treated with different precipitatants（n=3）
考察了不同沉淀剂体积对提取效率的影响。共考 |
资料快速通道
