叶酸的测定方法（微生物测定法）叶酸，维生素|科学仪器在线

1. 原理叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei，L.C，ATCC 7469简称L.C）生长所必需的营养素。在一定条件下，L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。
2. 适用范围参考Methods of Vitamin Assay，第四版。本方法适用于各类食物中叶酸的测定。检测限为0.1ng。
3. 仪器与设备（1）恒温培养箱。（2）离心机。（3）高压消毒锅。（4）振荡器。（5）接种针和接种环。（6）分光光度计。
4. 试剂除特殊说明外，本实验中所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。（1）菌种：酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei，L.C，ATCC 7469）。（2）磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH6.8）：称取4.35g Na3PO4·12H2O，10.39g Na2HPO4·7H2O溶解于800mL水中。临用前用约5g抗坏血酸调节pH至6.8 [注意：叶酸对光、热敏感，易被氧化破坏，抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化]。（3）鸡胰酶溶液：称取100mg干燥的鸡胰酶（Difco公司）[注意：含有叶酸轭合酶，用于水解叶酸多谷氨酸盐]，加入20mL磷酸缓冲液制成匀浆，3000r/min离心10min，取清液备用。临用前现配。（4）蛋白酶－淀粉酶溶液：分别称取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司），加入20mL磷酸缓冲液制成匀浆，离心3000r/min 10min，取上清液备用。临用前配制。（5）2＋8乙醇溶液：量取20mL无水乙醇溶液，加入80mL水混匀。（6）0.01mol/L NaOH：称取0.4g氢氧化钠，加2＋8乙醇溶液溶解并稀释至1L。（7）10mol/L NaOH：称取400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。（8）叶酸标准贮备液（200μg/mL）：准确称取200mg叶酸标准品（Sigma公司，纯度大于98％），用0.01mol/L NaOH溶解并定容至1L。贮存于棕色瓶中。（9）叶酸标准中间液（200ng/mL）：准确吸取1.0mL叶酸标准贮备液，用0.01mol/L NaOH溶解并定容至1L。贮存于棕色瓶中。待标定。标定：准确吸取1mL叶酸标准贮备液，用0.1mol/L NaOH定容至25mL。以0.1mol/L NaOH调零点，比色杯厚度1cm，波长256nm，测定3次紫外吸光度值，取平均值，按下式计算标准中间液浓度。
式中 ρ——叶酸标准贮备液浓度，μg/mL；
A——标准液平均紫外吸光度值；
E——摩尔消光系数24，500；
Mr——叶酸相对分子质量441.42；
25——测定紫外吸光度值时的稀释倍数；
103——由g/L换算成μg/mL的换算系数。（10）叶酸标准工作液（0.2ng/mL）：准确吸取1.0mL叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定容至1L。（11）2.4mol/L HCl：量取20mL浓盐酸，加水稀释至100mL。（12）酶解酪蛋白溶液：将8g碳酸氢钠溶解于1L水中，加入60g去维生素酪蛋白（Sigma公司），用10mol/L NaOH调节pH至8.0[注意：调pH时应小心，不要过碱后再加酸反复调节，避免酪蛋白结块]。加入300mg胰酶，搅拌20min，使胰酶混匀充分。再加入2.5mL甲苯，置37℃恒温箱酶解48～72h[注意：此步骤是将酪蛋白酶解为L.C可以利用的小分子肽。酶解时间不易超过72h，如时间过长，配成的培养基不利于细菌生长]。将酪蛋白液从恒温箱中提出，121℃高压30min以终止反应并去除甲苯。冷却，加10g硅藻土搅拌，用垫有滤纸的布氏漏斗过滤。向滤液中加入约60mL冰乙酸调节pH至3.7。称取活性炭12g，加入滤液中搅拌10min，用布氏漏斗过滤，重复3次。每次过滤时，布氏漏斗内加有10g硅藻土协助过滤。最后滤液用水稀释至1200mL，4℃冰箱保存1年[注意：活性炭可吸附酪蛋白中的叶酸以减少试剂空白，同时也可吸附肽及氨基酸，应注意控制搅拌时间]。取10mL酶解后的酪蛋白溶液加入已称重的蒸发皿中，沸水浴蒸发至干。将蒸发皿置于100℃恒温烤箱内干燥至恒重，在干燥器中冷却至室温。称量蒸发皿的质量，蒸发皿内固体重量，如固体质量小于400mg，即每毫升酪蛋白溶液中固体含量＜40mg，则弃除酪蛋白液，重新制备。（13）黄嘌呤溶液：取0.4g黄嘌呤，加入10mL氨水，加热溶解，用水稀释至100mL。冰箱保存。（14）腺嘌呤－鸟嘌呤－尿嘧啶：分别称取硫酸腺嘌呤，盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶各0.2g，加入2.4mol/L HCl溶液10mL，加热溶解，用水稀释至100mL，室温贮存。（15）乙酸缓冲液（1.7mol/L，pH4.5）：38.65g无水乙酸钠，19.8mL冰乙酸，加水稀释至500mL。（16）维生素溶液：取10mg核黄素溶解于40mL乙酸缓冲液中。取0.2mg生物素、2.5mg NaHCO3、20mg对氨基苯甲酸、40mg盐酸吡多醇、4mg盐酸硫胺素、8mg泛酸钙、8mg烟酸溶解于50mL水中。将上述两种溶液混合，加水至100mL。（17）吐温－80溶解：将2g吐温－80加入100mL 45℃水中，混匀。（18）还原型谷胱甘肽溶液：取0.1g还原型谷胱甘肽，加水至100mL。（19）甲盐溶液：称取5g磷酸氢二钾和2g磷酸二氢钾，加水溶解至100mL，液面上加入少许甲苯保存。（20）乙盐溶液：称取2g硫酸镁，0.5g硫酸亚铁和0.5g硫酸锰，加水至100mL；液面上加少许甲苯保存。（21）基础培养基：按下表配制，最终定容至500mL。

加水至100mL，置水浴煮至琼脂完全熔化，调节pH6.8±0.1。尽快倒入试管中，每管3～5mL，塞上棉塞，121℃高压灭菌15min，取出后直立试管，冷却至室温。于冰箱内保存。
5. 菌种制备保存（1）贮备菌种的制备：将L.C纯菌种转接至2个或多个琼脂培养基管中。（37±0.5）℃恒温培养箱中培养16～24h。贮于冰箱内，每周转种一次留作贮备菌种。（2）种子培养液的制备：取2mL叶酸标准使用液和10mL基础培养基，混匀，分装至4支5mL离心管中，塞上棉塞，121℃高压灭菌15min，实验时现制。
6. 操作步骤所有操作均避光进行。（1）样品制备：
① 强化剂型样品：称取0.1～0.5g样品（约含叶酸100～300ng）于100mL锥形瓶中，加入50mL磷酸缓冲液，混匀。121℃高压水解15min。定容至100mL，过滤。
② 果蔬类：称取样品0.2～2g（约含叶酸100～300ng），加磷酸缓冲液经高压水解后过滤，残渣用同样缓冲液再次高压，过滤。合并两次滤液，定容至100mL。
③ 谷、肉、蛋、鱼、豆、奶类等富含淀粉和/或蛋白类样品：称取样品0.1～2g（约含叶酸100～300ng），加磷酸缓冲液高压水解后，冷却。加入1mL鸡胰酶和1mL蛋白酶－淀粉酶液、1mL甲苯，充分混合，置于（37±0.5）℃恒温箱内酶解16～20h。酶解后定容至100mL过滤。另取一支试管，加入1mL鸡胰酶，1mL蛋白酶-淀粉酶和磷酸缓冲液，作酶空白。
④ 口服液、饮料、果汁等样品：称取样品0.5～2mL（约含叶酸100～300ng），加磷酸缓冲液高压水解后，冷却，加入1mL鸡胰酶，1mL甲苯，充分混合，置于（37±0.5）℃恒温箱内酶解16～20h。酶解后定容至100mL，过滤。另取一支试管，加入1mL鸡胰酶和磷酸缓冲液，作酶空白。（2）根据样品叶酸含量，将上述滤液用磷酸缓冲液稀释到一定倍数，使叶酸终浓度为0.1～0.4ng/mL。（3）样品管的制备：取4支试管，每支试管中分别加入稀释后样品液1.0、2.0、3.0、4.0mL，补充水至体积为5.0mL，加入5mL基础培养基，混匀。同样制作酶空白管。（4）灭菌：将以上标准系列管、样品管和酶空白管全部塞上棉塞，121℃高压灭菌15min。（5）标准系列管的制备：取试管分别加入叶酸标准工作液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，相当于叶酸含量0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ng，加水补至体积为5.0mL，再加5mL基础培养基，混匀。如样品管一样进行灭菌。标准系列管进行平行测定。（6）接种：
① 接种液的制备：接种前一天，用灭菌的接种针将菌种由贮备菌种管中转种至2支已灭菌的种子培养液中，（37±0.5）℃恒温培养箱中培养16～24h。混悬种子培养液，无菌操作下用接种针管将20滴种子培养液转移至另2支无菌的种子培养液中，（37±0.5）℃再培养6h。振荡混匀，制成菌种混悬液。立即使用[注意：叶酸是酪乳酸杆菌生长所必需的，但是如果培养基中叶酸含量过高，细菌可在体内贮存，使测定空白值，影响细菌生长曲线。将接种液转种再培养6h，有利于消耗细菌体内贮存的叶酸]。
② 接种：在无菌操作条件下向每支已灭菌的标准系列管、样品管和酶空白管接种一滴上述接种液[注意：应直接滴在培养基内]，混匀。留一支标准0管不接种，用于测定光密度时调零。（7）培养：置于（37±0.5）℃恒温培养箱中培养20～40h。（8）测定：用分光光度计，在波长540nm下，以未接种的标准0管调节零点，测定标准管、样品管和酶空白管的光密度值。
7. 计算（1）绘制标准曲线：以标准系列管中叶酸含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制叶酸标准曲线。（2）计算：根据样品管和酶空白管的光密度值，从标准曲线上查得相应的叶酸含量，按下式计算。
式中 x——样品中叶酸含量，μg/100g；
m1——从标准曲线上查得样品测定管中叶酸含量，ng；
m2——从标准曲线上查得酶空白管中叶酸含量，ng；
V1——样品制备时定容体积，mL；
f——稀释倍数；
V2——制备样品测定管时加入的样品液体积，mL；
m——样品质量，g；
10/1000——样品含量由ng/g换算成μg/100g的系数。
8. 注意事项（1）同一实验室平行测定或重复测定结果相对偏差绝对值＜10％。（2）微生物法的测定结果为总叶酸含量。（3）微生物法测定叶酸常用的菌种除酪乳酸杆菌外还有粪链球菌（Strepto-coccus faecalis，S.F.ATCC 8043）。用酪乳酸杆菌测定灵敏度高，用粪链球菌测定重现性好。本方法选用酪乳酸杆菌，实验条件以适宜酪乳酸杆菌的生长条件而定。（4）常用的酪蛋白处理方法有酶水解法、酸水解法和碱水解法，由于叶酸在碱性条件下相对稳定，所以用碱处理酪蛋白不能完全破坏叶酸，使培养基中叶酸含量偏高，标准空白值高，线性差。酸水解法和酶水解法均可有效去除叶酸，降解蛋白，使细菌生长曲线在0～1ng范围内线性良好，其中实验证明酶水解法更好。（5）培养基的pH对细菌生长很重要，pH6.8～7.2，生长曲线最佳。pH过低或过高均不利于细菌生长。（6）本方法配制的培养基和Difico公司的叶酸培养基比较，标准曲线线性基本一致，对样品检测结果基本一致。（7）食物中叶酸多以多谷氨酸盐形式存在，而酪乳酸杆菌只能利用叶酸单、双、三谷氨酸盐，所以对天然食品处理时先用轭合酶对叶酸进行降解。常用的轭合酶来源有血浆、鸡胰酶和猪肾酶。猪肾酶需从市售猪肾中提取，操作复杂，提取后对酶的鉴定相对困难，且重复性差，酶的用量难于控制。鸡胰酶可从Difco公司购买，可直接使用，重复性好。鸡胰酶的用量与叶酸测定结果相关，以往报告中认为水解200ng叶酸需加入0.1～1mg鸡胰酶。也有人认为在pH7.0的环境下增加酶的用量可提高叶酸水解率。本实验室认为水解200ng叶酸，鸡胰酶用量宜控制在3～5mg左右，过高可降低水解效果。（8）轭合酶在应用中也有其局限性。天然食物中往往也含有轭合酶，在食物贮藏、运输过程中叶酸衍生物之间可发生相互转化，使外源性轭合酶作用下降；并且蔬菜水果存在一些酶的干扰物质也影响酶的活性，如柠檬酸、鞣酸等。所以测定中样品需注意保鲜，及时测定；样品处理方法也应视样品性质而定。（9）蛋白酶、淀粉酶的应用可将包裹于蛋白、淀粉之间或蛋白结合的叶酸释放，有助于样品检测。蛋白酶、淀粉酶、鸡胰酶联合应用，水解效力大于3酶效力之和。

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